Droplet digital PCR| Département : Biologie, Signaux et Systèmes en Cancérologie et Neuroscience. Responsable scientifique : Jean-Louis MERLIN Responsable technique : Alexandre HARLÉ Post-doctorat : Pauline GILSON (2017–2019) |
Objectif scientifique
Détection d’évènements rares et quantification absolue par PCR
Description
L’équipement emploie une technique de PCR de 3ème génération permettant la quantification absolue de cibles
d’ADN sans gamme étalon. L’échantillon et son mix de PCR est émulsionné, dans une huile spéciale par un
générateur de gouttelettes, ce qui crée un partitionnement de son contenu en ADN et génère plusieurs milliers
de bioréacteurs individuels de PCR. Il subit ensuite une PCR en point final (dans un appareil de PCR standard).
Enfin, la lecture de la fluorescence des gouttelettes est faite par un lecteur qui analyse successivement la fluorescence
de chaque gouttelette. Le partitionnement de l’échantillon permet une augmentation de la sensibilité
par rapport à un appareil de qPCR classique. On regarde ici uniquement si la PCR est positive ou négative. Le
logiciel associé calcule la fraction du partitionnement positif puis estime la concentration de cible initiale par
modélisation d’une distribution selon une loi de Poisson.
Sensibilité analytique : 0,001%.
Analyse simultanée de 96 échantillons possible
Exemples de réalisations
Instabilité des microsatellites dans les cancers colorectaux et de l’endomètre
Cet équipement a été utilisé
dans le cadre d’un programme de validation de méthode pour la détermination de l’instabilité des microsatellites
dans les cancers colorectaux et de l’endomètre. En routine diagnostique, cette analyse est prescrite pour l’étude
du syndrome de Lynch et, par ailleurs pour guider la prescription de l’immunothérapie. Dans ce programme,
les résultats obtenus par ddPCR ont été comparés à ceux obtenus en routine clinique par immunohistochimie
(IHC), par PCR standard. Les résultats obtenus par ddPCR sont concordants à 100% avec ceux des techniques
de référence (PCR et IHC) et permettant d’envisager l’utilisation de la ddPCR pour des analyses de routine
diagnostique. Ce travail a fait l’objet d’une publication.
Mutation du gène EGFR dans les cancers bronchiques non à petites cellules
La recherche des mutations
du gène EGFR fait partie du bilan diagnostique moléculaire des cancers bronchiques non à petites cellules ou
non small cell lung cancer (NSCLC). Notre étude a consisté à valider les performances de la ddPCR intégrée
dans un kit diagnostique commercial permettant la mise en évidence de mutations du gène EGFR impliquées
dans la sensibilité ou la résistance aux inhibiteurs de kinase anti-EGFR de 1ère, 2e ou 3e génération. Les
analyses ont été réalisées à partir d’ADN extrait de fragments biopsiques ou d’ADN libre circulant extrait d’un
prélèvement sanguin (biopsie liquide).
Ce travail a été confié à une étudiante stagiaire en master 2. Les résultats obtenus montrent que le niveau de
performance de la ddPCR appliquée à la recherche de mutations du gène EGFR est compatible avec son usage
en routine diagnostique. Un programme de validation de méthode est envisagé.
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| FIGURE 54 – Droplet digital PCR (QX200TM, Biorad) : Cet équipement comprend 1 générateur de goutelettes, 1 thermocycleur et 1 lecteur de goutelettes. |
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| FIGURE 55 – Représentation schématique d’une analyse. |
